卵黄抗体对艰难梭菌感染的治疗潜力

来源:国外畜牧学—猪与禽    作者:张江    人气:    发布时间:2019-11-13    
卵黄抗体对艰难梭菌感染的治疗潜力
 
译者:张江
摘要:常规抗生素会改变正常肠道菌群的数量和复杂性,进而会降低这些具有保护作用的微生物在胃肠道内的竞争性定植的能力。因此,容易导致艰难梭菌感染(Clostridium Difficile Infection,CDI)。一旦在结肠中定植,艰难梭菌会产生毒素A(Clostridium difficile Toxin A,TcdA)和毒素B(Clostridium difficile Toxin B,TcdB),引起包括腹泻、伪膜性结肠炎、中毒性巨结肠及可能致命的多系统器官衰竭等临床症状。
 
中图分类号:S816.71                          文献标识码:C
 
  常规抗生素会改变正常肠道菌群的数量和复杂性,进而会降低这些具有保护作用的微生物在胃肠道内的竞争性定植的能力。因此,容易导致艰难梭菌感染(Clostridium Difficile Infection,CDI)。一旦在结肠中定植,艰难梭菌会产生毒素A(Clostridium difficile Toxin A,TcdA)和毒素B(Clostridium difficile Toxin B,TcdB),引起包括腹泻、伪膜性结肠炎、中毒性巨结肠及可能致命的多系统器官衰竭等临床症状。
  治疗CDI公认的方法是使用对艰难梭菌敏感的抗生素。在大约80 %的病例中,这种治疗方法会完全康复,而在剩余病例中,会发生迁延性CDI(rCDI),这是因为停用甲硝唑抗生素后未能重建正常胃肠道菌群,导致对艰难梭菌敏感人群复发或再发生CDI。
  虽然对TcdA和TcdB在CDI发病机制中的作用了解较多,但对其在艰难梭菌肠道定植中的作用了解甚少。不过,有迹象表明,艰难梭菌的确在哺乳动物胃肠道中定植。比如定植艰难梭菌的无症状患者表现出发生CDI风险下降,以克林霉素治疗的仓鼠预定植不产毒艰难梭菌可保护动物不受随后野生型产毒菌株感染的影响。此外,CDI患者恢复期血清含有艰难梭菌细胞壁相关成分的抗体(如FliC、FliD、Fbp68、SlpA、Cwp66和Cwp84),在体外研究中发现这些成分与微生物定植有关。
  本研究使用了三种公认的艰难梭菌定植因子(CFs)特异性卵黄抗体(IgY)和候选疫苗,即鞭毛的结构蛋白(鞭毛蛋白)FliC、鞭毛帽蛋白FliD及84 kDa细胞壁相关半胱氨酸蛋白酶Cwp84(参与表面层蛋白SlpA的正确加工和组装)。有充分证据表明,在通过多种哺乳动物的胃肠道后,纯化的IgG及IgY抗体仍保持其抑菌活性。CF-特异性IgY制剂可促进CDI患者清除肠道中的艰难梭菌,同时保护正常胃肠道菌群,降低rCDI的发病率。
1  方法
1.1 艰难梭菌菌株及培养方法
  艰难梭菌630菌株承蒙韦尔科姆基金会桑格研究所的Trevor Lawley博士提供。艰难梭菌VPI 10463(ATCC 43255)菌株从美国典型菌种保藏中心获得。艰难梭菌菌株常规培养在源于冷冻原液的Y琼脂平板培养基中[脑心浸液(BHI)琼脂,含5 %绵羊血、5 mg血红素和1 mg的维生素K1],并在Bactron III型厌氧培养箱中37 ℃厌氧培养48 h。在黏附试验中,将单个菌落接种于BHI培养基,并在37 ℃下厌氧培养18 h,直至培养物达到指数生长后期。
  用于验证泳动琼脂分析的艰难梭菌630 fliC基因阻断突变株(Cdi-fliC-260a)按照Heap等介绍的方法在实验室利用基于ClosTron组II型内含子突变系统构建。Western免疫印迹分析、透射电镜和琼脂管泳动分析表明,这种fliC基因阻断突变株缺乏生成鞭毛蛋白(FliC)以及组装功能性鞭毛丝状体的能力。
1.2 人体肠道T84细胞培养物状况
  T84细胞在5 % CO2、37 ℃的24孔组织培养平板中培养,所用培养基为添加10 %胎牛血清的DMEM/F12培养基。
1.3 克隆FliC、FliD和Cwp84抗原
  FliC、FliD和Cwp84基因是由卡尔加里大学医学院托马斯•路易博士提供的艰难梭菌卡PCR扩增而得。按照文献所述设计PCR引物,然后按厂家说明将PCR产物克隆到pQE-30 UA。用标准的化学转化方法将克隆产物转化到大肠杆菌M15细胞。按照厂家对pQE-30克隆系统的说明进行6xHis-标记蛋白的表达和纯化。采用SDS-PAGE(12.5 %分离胶)分析纯化蛋白(图1),通过对凝胶蛋白质条带所获胰蛋白酶肽的质谱分析确认其成分。
 

 
1.4 鸡的免疫方案
  抗原制剂(0.1 mg Ni-亲和纯化6xHis-标记重组抗原/0.5 mL PBS,pH 7.2)在弗氏完全佐剂(1∶1)中乳化,肌内注射给5月龄白来航胸肌。首次注射两周后,相同剂量相同方式强化注射,2周后再次重复。第二和第三次注射以弗氏不完全佐剂代替完全佐剂。最后一次注射后一周集蛋,处理前2 ℃—4 ℃下储存。
1.5 从冻干蛋黄粉中提纯CF-特异性IgY
  将2 g冻干蛋黄粉溶于150 mL冰冷蒸馏水中,使用Waring混合机高速均质1 min,然后将pH调至5.0。2 800转下离心40 min,调节上清液pH至4.0,加入活性炭至终浓度0.01 %(w/v)。以2 800转的速度再次离心30 min,所得上清液以Wahtman1号滤纸过滤。滤过液用Amicon超滤杯以100 kDa的超滤膜浓缩至30 mL。浓缩的IgY溶液pH调节至9.0,加入40 %硫酸铵4 ℃下沉淀蛋白质1 h。然后以3 000转离心溶液30 min。获得的硫酸铵沉淀溶解在15 mL 0.01M Tris/HCl中(pH 8.0),再次以40 %硫酸铵4 ℃下沉淀IgY 1 h。最后3 000转离心30 min,沉淀物溶解于钠/钾 PBS(pH 7.2)中,使用50 kDa超滤透析膜透析过夜。
1.6 SDS-PAGE和Western免疫印迹
  重组6x His-标记FliC、FliD和Cwp84从大肠杆菌Ni-亲和纯化,并使用12.5 %的分离胶进行SDS-PAGE分析。分离出的蛋白转移至PVDF膜,200 V下电泳45 min。用5 %脱脂奶Tris缓冲液(TBSTM,含0.05 %Tween20,pH 7.4)封闭。初级IgY抗体稀释在TBSTM中,并在膜下孵育1 h。然后与结合辣根过氧化物酶的羊抗-IgY二抗以1∶10 000稀释添加到TBSTM,并与膜一起孵育1 h。以TBST(不含5 %脱脂奶的TBSTM)充分洗膜后,按照供应商的说明以持久性化学发光底物检测试剂盒进行免疫反应性蛋白成像。
1.7 艰难梭菌泳动检测
  泳动琼脂试管中含有终浓度为0.175 %的琼脂BHI溶液。添加IgY抗体至终浓度为10 mg/mL。过夜培养物中获得的艰难梭菌630菌株和Flic基因阻断突变菌株垂直注入琼脂。然后将试管在37 ℃下厌氧培养24 h。
1.8 仓鼠保护实验
  体重80 g—100 g的雄性叙利亚仓鼠(Harlan实验室)在试验前5 d以溶解于PBS的克林霉素磷酸酯灌胃处理,剂量为30 mg/kg体重。5 d后(试验第0天),仓鼠灌胃接受悬浮于DMEM/F12的103艰难梭菌菌630株孢子。以未免疫鸡卵黄处理的仓鼠在试验第0天以及此后每隔10 d接受悬浮于0.5 mL 0.1 M碳酸盐缓冲液(pH 9.0)的45 mg冻干粉。仅以纯化FliD-特异性IgY处理的仓鼠每天接受溶于0.5 mL碳酸氢盐缓冲液中的0.5 mg蛋白(使用二辛可宁酸测定法测定),为期10 d。以来源于未免疫鸡卵黄的纯化重组FliD-特异性IgY处理的动物每天接受相同量的FliD-特异性IgY(0.5 mg蛋白)+溶解于0.5 mL碳酸氢盐缓冲液中的45 mg冻干蛋黄粉,为期10 d。每4 h检查仓鼠,出现CDI症状时(肛周染色、反应迟钝)马上CO2处死。
1.9 免疫标记程序
  单一的艰难梭菌630菌落在2 %甲醛/0.5 %戊二醛的50 mM二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)中厌氧悬浮20 min。然后将10 µL的固定化细菌添加到活性炭涂布的透射电镜格栅2 min,过量溶液用滤纸轻轻吸去。将格栅样品面向下浮于50 µL 5 % BSA的PBS溶液1 h,进行封闭。然后将格栅转移至50 µL 1∶50稀释的FliD-特异性IgY溶液或稀释在5 %BSA中的对照IgY溶液1 h。以PBS彻底洗涤后,将格栅转移至50 mL 1∶25稀释、结合有15 nm金粒的羊抗-IgY 1 h。以PBS洗涤后,添加10 mL的1 %磷钨酸进行格栅染色(pH 7.0)10 s。用滤纸轻轻吸去过量染色液,并使用日立H-7650透射电镜检查干燥格栅。
1.10 T84细胞艰难梭菌黏附试验
  所有试验均重复3次。生长后期指数阶段(OD600=0.65)的艰难梭菌VPI 10463培养物稀释于过夜预还原的DMEM/F12[含CF-特异性或对照卵黄IgY制剂(1 mg/mL)],并添加到浓度大约为106 cfu/mL(m.o.i.=1∶1)T84细胞单层中。组织培养平板在37 ℃下厌氧孵育3 h,然后以无菌PBS洗涤5次,以除去非贴壁细菌。在3 h的厌氧培养后使用MTT细胞殖测定法测定T84细胞的活力。为测定黏附细菌数量,以含有1 mM EDTA的0.25 %胰蛋白酶处理T84细胞,然后在无菌PBS中稀释10倍。随后将稀释液分三份接种于Y琼脂平板上。将平板在37 ℃下厌氧培养48 h,所得菌落稀释至30—300个菌落/平板后计数。
2  结果
  图1为SDS-PAGE凝胶图像,对用于免疫鸡的Ni-亲和纯化重组艰难梭菌FliC、FliD和Cwp84抗原进行分析。箭头所指条带从凝胶中切除,并用于质谱分析中3种纯化蛋白鉴别。
  根据厌氧条件下抑制艰难梭菌VPI10463菌株黏附结肠T84细胞单层的能力,对重组艰难梭菌FliC、FliD或Cwp84免疫的鸡所产卵黄进行初步筛选。试验结果(图2)表明,含FliD-特异性IgY的卵黄抑制艰难梭菌对T84细胞单层黏附效果明显优于其他未免疫鸡所产卵黄(P<0.001)或有FliC-特异性IgY的卵黄(P<0.05)。虽然以1∶1∶1比例混合的三种CF-特异性卵黄制剂混合物抑制艰难梭菌黏附T84细胞的效果显著优于(P<0.05)FliC-特异性卵黄,不过3种制剂的混合并未优于FliD-特异性制剂的抑制效果。因此,选择含有FliD特异性-IgY的卵黄作进一步评估。
 

 
  采用此前Ko和Ahn报道的两步活性炭脱脂硫酸铵沉淀法由冻干卵黄纯化获得FliD特异性-IgY。SDS-PAGE分析(图3a)表明使用这种简单有效的方法纯化IgY主要形成分子量为68 kDa和30 kDa的蛋白质特征条带,分别为IgY的重链和轻链。图3(b)的结果表明,在免疫印迹中与FliD抗原结合的纯化FliD-特异性IgY制剂与FliC或Cwp84抗原没有交叉反应。此外,抗原捕获型ELISA结果表明,与FliD-特异性卵黄粗制剂相比,冻干蛋黄纯化FliD-特异性IgY可显著提高其滴度(图4)。此外,琼脂泳动分析表明,与含对照IgY或不含IgY的琼脂泳动相比,FliD-特异性IgY制剂可降低艰难梭菌630菌株的活动性(图6)。
 







 
  五项独立仓鼠CDI保护试验得到的累计存活结果如图7所示。数据表明,与接受未免疫鸡卵黄相比,单独使用纯化FliD-特异性IgY碳酸盐缓冲液可显著提高(P<0.05。双尾Fisher精确检验)仓鼠感染浓度为103的艰难梭菌630菌株孢子的存活率。此外,含对照卵黄的重组纯化FliD-特异性IgY未显著改变其在仓鼠CDI试验中的保护效力。
 

 
3  讨论
  我们希望检验这样一个假设,即针对艰难梭菌毒力因子的治疗方式可能是一种更为有效的CDI治疗或辅助治疗措施。此前有证据表明FliD黏附于鼠盲肠黏液制剂,这表明这种鞭毛成分不仅具有调节鞭毛组装作用及运动功能外,还是艰难梭菌的黏附素。另一项研究表明,CDI感染者生成艰难梭菌FliD、FliC、一种纤连蛋白结合蛋白Fpb68和Cwp66的血清抗体,且对艰难梭菌FliD比对FliC产生更为强烈的免疫应答。
  本文给出的结果确认了艰难梭菌FliD鞭毛帽蛋白特异性IgY作为一种CDI或rCDI患者的替代性治疗或辅助治疗方法的可行性。观察结果表明,对仓鼠CDI提供良好保护的FliD-特异性IgY制剂与这些抗体抑制艰难梭菌黏附于结肠T84细胞的卓越效果有关(图2)。
  除了在艰难梭菌定植过程中的重要作用外,FliD-特异性IgY制剂在治疗仓鼠CDI中的成功也可能与抗体似对抗原决定簇具有高亲和力以及FliD蛋白接触到抗原决定簇的数量有关。即使稀释100 000倍,FliD-特异性IgY制剂在Western免疫印迹中的反应性(图3b)证明这些多克隆抗体仍对FliD抗原上抗原决定簇具有亲和力。IgY制剂的高亲和力也可能表示在通过宿主胃肠道期间高比例抗体的优势。如果存活的成分仍然能够使致病菌失能,到达感染肠道部位时有多少制剂仍然保持物理完整性和活性并不重要。

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责任编辑:马晓迪
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